万寿菊(Tagetes erecta L.)是菊科万寿菊属一年生草本花卉，又名蜂窝菊，原产墨西哥及美洲地区，头状花序、花大色艳、花期长、易栽培管理、栽培品种多，具有较高的观赏价值(张继冲等, 2005)。由于其花内叶黄素含量高，还是提取纯天然黄色素的理想原料(Sreekala and Raghava, 2003)。万寿菊雄性不育系具有非常明显的种质资源优势，杂交种繁育常利用雄性不育两用系的不育系作母本，与强优势的恢复系杂交，配制F₁杂交种用于生产。分子标记技术可以分析万寿菊雄性不育系的遗传关系，为能有效地利用万寿菊雄性不育系种质资源选育万寿菊新品种提供分子生物学依据。

简单序列重复区间扩增多态性DNA分子标记(inter-simple sequence repeat, ISSR)，是在简单重复序列(simple sequence repeat, SSR)分子标记技术基础之上发展起来的一种基于PCR的新型DNA分子标记技术。它结合了SSR和RAPD的优点，实验操作简单、特异性强、多态性丰富、稳定性好、耗资少。因ISSR在不知道基因组序列的情况下即可用引物进行PCR扩增，从而可简化了前期工作。ISSR标记技术目前已广泛应用于植物遗传图谱构建、植物分类、种质资源鉴定、遗传多样性分析等研究中。目前已在菊花(张飞等, 2010)、石蒜(田晓俊和符树根, 2012)、山茶(林立等, 2012)及牡丹(杨美玲和唐红, 2012)等众多花卉植物中进行了研究利用。

目前国内对万寿菊属植物的研究，多集中于栽培生长(Sangwan et al., 2010)、叶黄素研究(Sowbhagya et al., 2011; Luis et al., 2004; 王国兰等, 2012)及生理特性(李浦等, 2012; Liao et al., 2012; 田治国等, 2011)等方面。在DNA分子标记方面，对万寿菊属植物的研究并不多见，其中有杨帆等(2011)对万寿菊SSR-PCR体系优化进行了研究；沈一岚等(2006)对万寿菊的RAPD分子标记进行了研究；张西西等(2008)对万寿菊进行了SRAP标记分析研究。在ISSR-PCR分子标记技术方面，到目前为止，尚未见到采用ISSR标记法对万寿菊雄性不育两用系进行遗传多样性的报道。

本研究利用青海大学高原花卉研究中心的9个万寿菊雄性不育两用系为试验材料，采用单因素试验和正交试验设计方法，通过研究ISSR-PCR反应中各项参数变化对试验结果的影响，优化ISSR-PCR反应体系，筛选出适合万寿菊雄性不育系ISSR研究的引物，旨在建立适合万寿菊雄性不育系的ISSR反应体系，为万寿菊遗传多样性、种质资源筛选和分子标记辅助育种等方面的研究奠定基础。

1结果与分析
1.1 Mg²⁺浓度对ISSR-PCR反应的影响
图1结果显示，Mg²⁺浓度低，扩增效果差，条带模糊。当Mg²⁺浓度为0.5 mmol/L时，只扩增出了1条可辨的条带，扩增效果差。Mg²⁺浓度增加时，扩增出的条带数也在增多，当Mg²⁺浓度增加至1.5 mmol/L时，扩增出的条带最齐全，条带也最为稳定清晰。当Mg²⁺浓度大于1.5 mmol/L时扩增出来的条带数减少，扩增条带也逐渐模糊。因此，1.5 mmol/L的Mg²⁺浓度扩增效果最好。

图1 Mg2+浓度对ISSR-PCR的影响 Figure 1 Effects of Mg2+ concentration on ISSR-PCR

1.2 dNTPs浓度对ISSR-PCR反应的影响
由图2可知，当dNTPs浓度为小于0.2 mmol/L时，因其浓度低，PCR产物较少，导致扩增的条带数也比较少，dNTPs浓度为0.1 mmol/L时，仅扩增出了1条模糊的条带。当dNTPs浓度为0.2 mmol/L时，扩增出的条带数最多，条带稳定，效果比较好。因此，在25 μL体系中，dNTPs最佳浓度为0.2 mmol/L。

图2 dNTPs浓度对ISSR-PCR的影响 Figure 2 Effects of dNTPs concentration on ISSR-PCR

1.3 ISSR引物浓度对ISSR-PCR反应的影响
图3显示不同的引物浓度对万寿菊雄性不育系ISSR-PCR的影响。在不同引物浓度下，ISSR-PCR均能扩出条带。当引物浓度为1.0 μmol/L和1.25 μmol/L时，引物浓度过高，扩增出的条带少并且条带模糊。当引物浓度为0.50 μmol/L时，扩增条带的数量最多，条带清晰，多态性好。因此，适宜万寿菊雄性不育系ISSR反应的引物浓度为0.50 μmol/L。

图3 引物浓度对ISSR-PCR的影响 Figure 3 Effects of primer concentration on ISSR-PCR

1.4 Taq DNA聚合酶浓度对ISSR-PCR反应的影响
在25 μL体系中，当Taq DNA聚合酶含量为1.0 U时，扩增条带最多，条带整齐清晰(图4)。当Taq DNA聚合酶大于1.0 U时，随着Taq DNA酶用量的逐渐加大，扩增条带的带数明显减少，条带模糊，亮度逐渐减弱，直至扩增不出条带。因此，1.0 U的Taq DNA聚合酶为适宜的Taq酶含量。本试验中，Taq酶含量对体系的影响不大，Taq酶浓度在各水平间的结果均值差异不显著，扩增结果无规律性的变化。

图4 Taq酶含量对ISSR-PCR的影响 Figure 4 Effects of Taq polymerase content on ISSR-PCR

1.5 ISSR-PCR正交试验设计
1.5.1 ISSR-PCR正交试验结果分析
根据L₂₅(5⁴)正交试验ISSR-PCR产物电泳结果(图5)，依据PCR产物电泳条带的多少、清晰程度及稳定状况对25个组合进行评分，分数越高，表示特异性越好。每个组合作1~25分计分，最好的组合赋值为25分，最差的赋值为1分。25个组合的分数依次为：4、17、12、10、18、6、11、15、19、20、2、13、16、25、21、3、5、22、23、24、1、8、14、7和9。采用穆立蔷等(2006)的方法，求出每个因素同一水平下的得分总和Ki及平均值ki，并求出同因素不同水平间的极差R，然后用SAS数据处理系统进行对正交试验结果进行方差分析。在极差分析中(表1)，通过极差R值看出：dNTPs对万寿菊雄性不育系ISSR-PCR反应的影响最大，极差值为15.2；其次是Mg²⁺和引物；Taq DNA聚合酶浓度对万寿菊雄性不育系ISSR-PCR反应的影响最小，极差值为3.4。在方差分析中(表2)，由F值可知，各因素水平变化对PCR反应影响大小依次为：dNTPs、Mg²⁺、引物、Taq酶，这与极差分析结果一致。

图5 万寿菊雄性不育系ISSR-PCR正交试验 Figure 5 ISSR-PCR orthogonal test on marigold male sterile lines

表1 正交试验结果极差分析 Table 1 Range analysis of orthogonal test results

表2 正交试验结果方差分析 Table 2 Variance analysis of orthogonal test results

对各因素内的不同水平进行比较(表3)，可以看出：随着Mg²⁺浓度的增加，扩增结果均值先增大后减小，在1.5 mmol/L和2.0 mmol/L时均值最大，与其他3个水平间差异达到了极显著水平。结合单因素试验，本研究以浓度0.5 mmol/L为最佳Mg²⁺浓度；随着dNTPs浓度的增加，扩增结果均值在逐渐增大，在0.30 mmol/L时均值最高，dNTPs浓度在0.20 mmol/L与0.25 mmol/L间均值差异不显著，在0.10 mmol/L与0.30 mmol/L之间差异显著，结合单因素试验，确定0.2mmol/L浓度为最佳dNTPs浓度；引物浓度在各水平之间均值差异不显著，在引物浓度为0.5 μmol/L时均值最大，因此本试验以0.5 μmol/L为最佳引物浓度；Taq酶含量在各水平之间的均值差异不显著，扩增结果的均值无规律性变化，说明在本试验设定梯度范围内Taq酶含量对体系的影响不大。在本研究中以1 U为最佳Taq酶用量。

表3 各因素不同处理水平结果均值差异显著性 Table 3 Significance of difference among mean value of different factors and levels

1.5.2最优ISSR-PCR反应体系
根据研究结果得到万寿菊雄性不育两用系ISSR-PCR反应的最优体系为：25 μL体系中，Mg²⁺浓度为1.5 mmol/L、dNTPs浓度为0.20 mmol/L、引物浓度为0.5 μmol/ L、模板DNA为60 ng、Taq DNA聚合酶含量为1 U。

1.6模板DNA浓度对ISSR-PCR反应的影响
不同模板DNA浓度对ISSR-PCR扩增结果有较大影响(图6)，在25 μL体系内，不同量的模板DNA虽都能扩增出清晰的条带，但在模板DNA浓度为60 ng时，扩增出的条带数最多，条带齐整稳定，扩增效果好。因此，确定25 μL体系中，60 ng模板DNA为最适宜的模板DNA浓度。

图6 模板浓度对ISSR-PCR的影响 Figure 6 Effects of template concentration on ISSR-PCR

1.7引物筛选
根据PCR产物电泳图，以扩增条带数、条带清晰可辨度及多态性条带数为筛选条件，从100条ISSR引物中共筛选出15条较适宜万寿菊雄性不育系的引物(表4)。

表4 引物筛选结果 Table 4 The result of primer screening

1.8引物退火温度的确定
退火温度也对PCR扩增也有一定影响，退火温度为引物和模板结合时的温度参数，它是影响PCR特异性的较重要因素。引物UBC823 (5’-TCTCTCTCTCTCTCTCC-3’)的Tm温度为52℃，退火温度的优化范围为47.0℃~57.0℃。引物UBC823在所设定的12个温度内均能扩增出清晰明亮的多态性条带，但在退火温度为52.6℃时，扩增的条带数最多，质量好，背景清晰，条带也最为明亮(图7)。因此，引物UBC823的最佳退火温度为52.6℃。通过对筛选出的16条引物的退火温度确定试验知道，万寿菊雄性不育系多数引物适合较低的退火温度(46℃~53℃)。

图7 退火温度对ISSR-PCR的影响 Figure 7 Effects of annealing temperature on ISSR-PCR

1.9 ISSR-PCR反应体系稳定性检验
根据优化的万寿菊雄性不育系ISSR-PCR反应体系，从筛选出的15条ISSR引物中随机挑选1条对9个雄性不育系总DNA进行扩增。结果表明，9个万寿菊雄性不育系总DNA均能扩增出清晰可辨、高质量的条带，证明了优化的万寿菊雄性不育两用系ISSR-PCR反应体系稳定性强、可靠性高，可用于ISSR分子标记研究万寿菊雄性不育两用系资源(图8)。

图8 引物UBC7对9个万寿菊雄性不育系模板DNA的ISSR-PCR扩增结果 Figure 8 Amplification result of template DNA of nine marigold male sterile lines by Primer UBC7

2讨论
ISSR技术是一种基于PCR的DNA分子标记，PCR反应的结果主要受Mg²⁺、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶及模板DNA 5个因素浓度的影响，但这5个因素对PCR扩增结果的作用在不同植物中并不一样。所以，为扩增出稳定清晰、质量高的条带，必须对每一种植物的PCR反应体系进行优化。

本研究中，对ISSR-PCR反应体系的优化采用单因素试验和正交试验两种方法，两种方法的结合与互补提高了试验结果的准确性。通过对两种方法试验结果的分析比较，得到最适因素水平组合，建立了适合万寿菊雄性不育系ISSR-PCR反应体系。

在正交试验中，通过对PCR扩增结果进行极差和方差分析，了解到在反应体系优化试验中，dNTPs浓度对万寿菊雄性不育系ISSR-PCR扩增结果的影响最大，这与代文娟等(2011)的研究结果一致，因为dNTPs是PCR反应的原料，在PCR反应中的作用非常重要，浓度过高，会影响Mg²⁺浓度，使反应体系中的Mg²⁺总量下降，从而影响反应体系；低浓度的dNTPs，会降低反应速度，减少PCR产物并使产物单链化，影响扩增结果。ISSR-PCR反应中，Mg²⁺和引物浓度对PCR反应体系的影响次之。正交试验中，Taq酶含量对PCR反应体系的影响最小，这与大部分植物ISSR-PCR反应体系研究的结果不同，这与植物材料种类有关，也与正交试验设计采用的主观打分产生的试验误差有关。

万寿菊雄性不育系ISSR-PCR体系的建立是进行万寿菊雄性不育系ISSR分子标记的前提，本试验通过优化万寿菊雄性不育系ISSR-PCR反应体系中的各项参数，建立了适用于万寿菊雄性不育系的ISSR反应体系。利用优化的反应体系对万寿菊雄性不育系的总DNA进行PCR扩增反应，能得到清晰、重复性好、多态性丰富的扩增条带，为进一步利用ISSR-PCR标记技术研究万寿菊雄性不育系的种质资源遗传多样性，以期探明万寿菊的雄性不育机理以及分子选育万寿菊新品种等奠定了试验基础。

3材料与方法
3.1试验材料和试剂
试验选用9个万寿菊雄性不育系植株上的嫩叶，置于-80℃超低温冷冻储存备用。参照University of British Columbia公布的序列，设计100条引物，并由北京六合华大基因科技股份有限责任公司合成。PCR所需的10×PCR Buffer without Mg²⁺、Mg²⁺、Taq DNA聚合酶、dNTPs Mix及DNA Marker均购自北京博友新创生物技术有限公司。

3.2叶片总DNA提取与检测
采用改良的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取万寿菊雄性不育系总基因组DNA，加入50 μL灭菌ddH₂O溶解，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳和核酸检测仪对总基因组DNA的质量和浓度进行检测，提取好的总DNA置于-20℃保存。

3.3 ISSR-PCR反应体系优化
3.3.1 ISSR-PCR单因素试验设计
参照其他植物ISSR-PCR反应的条件，在25 μL ISSR-PCR扩增体系中，初步设定PCR扩增反应中Mg²⁺、dNTPs mix、引物及Taq DNA聚合酶的浓度参数，采用梯度试验的方法分别对体系中的Mg²⁺浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq酶浓度4个因素进行优化。各因素的浓度梯度见表5。扩增程序中以引物UBC811 (5’-GAGAGAGAGAGAGAGAC-3’)为优化试验的引物。优化试验PCR扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，53℃退火45 s，72℃延伸2 min，进行39个循环；最后在72℃下延伸10 min；反应结束后4℃保存。其PCR反应产物在1.5%琼脂糖凝胶(含有0.2%的EB)中电泳2 h，电泳缓冲液为1×TBE，稳定电压为100 V，凝胶成像系统进行拍照分析。

表5 ISSR-PCR反应体系的因素与水平设计 Table 5 Factors and levels design of ISSR- PCR reaction system

3.3.2 ISSR-PCR正交试验设计
采用L₂₅(5⁴)正交试验设计，各因素的浓度梯度参照表5。根据L₂₅(5⁴)正交试验设计表配制总体积为25 μL的反应体系，包括2.5μL 10× PCR Buffer和40 ng模板DNA，最后用灭菌ddH₂O补足至25 μL，每个处理设3次重复。扩增程序同单因素试验设计，扩增结果用SAS数据处理系统分析。


3.3.3模板DNA浓度对ISSR扩增的影响
根据以上试验的最佳组合，引物选用UBC811，模板DNA浓度设置10 ng、20 ng、40 ng、60 ng、80 ng及100 ng 6个水平，每个水平设置3次重复。

3.3.4引物筛选
根据最优试验组合，分别对100条ISSR引物进行PCR反应，通过分析PCR反应结果筛选出扩增效果好的引物。

3.3.5退火温度的优化
采用梯度PCR模式，根据引物的Tm值，设置温度变化±5℃，PCR仪自动生成12个温度梯度，进行ISSR-PCR反应以确定最优的退火温度。每个梯度设3次重复。

作者贡献
伍亚平是本研究的实验设计和实验研究的执行人，完成数据分析，论文初稿的写作；唐道城是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由青海省科技厅项目(2007-N-114)和科技部农转资金(2009GB2G200396)共同资助。

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